作业帮PCR不能扩增出目的条带,用的是文献中提供的引物总是扩增不出来,目的片段279bp,我用的条件是94℃,5min；94℃,30s,50℃,30s,72℃,45s,30个循环；72℃,5min.其中退火温度有试过56℃,58℃,都不行,只有引
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/12 12:32:45
PCR不能扩增出目的条带,用的是文献中提供的引物总是扩增不出来,目的片段279bp,我用的条件是94℃,5min；94℃,30s,50℃,30s,72℃,45s,30个循环；72℃,5min.其中退火温度有试过56℃,58℃,都不行,只有引
PCR不能扩增出目的条带,用的是文献中提供的引物
总是扩增不出来,目的片段279bp,我用的条件是94℃,5min；94℃,30s,50℃,30s,72℃,45s,30个循环；72℃,5min.其中退火温度有试过56℃,58℃,都不行,只有引物二聚体.下过一段该序列基因,比对了一下,引物应该没啥问题
PCR不能扩增出目的条带,用的是文献中提供的引物总是扩增不出来,目的片段279bp,我用的条件是94℃,5min；94℃,30s,50℃,30s,72℃,45s,30个循环；72℃,5min.其中退火温度有试过56℃,58℃,都不行,只有引
建议：
1、用引物在ncbi里去查,看看是否完全匹配,国外文献尚有错误,如果是国内的.；
2、不是提高退火温度,而是降低,看看是否有非特异性的产物；
3、有条件的话,建议找一个阳性对照,质粒最方便.如果没有这个基因的,可以找一个看家基因的,再合成一对引物,做阳性对照.检查整个体系中是否有问题.阳性对照和阴性对照是做PCR必须的,出了问题就容易判断了
1 模板是什么？总DNA？质粒？RT产物？尝试将模板稀释10倍
2 做个温度梯度。
3 文献里的引物有可能是不对的，写文章的时候引物信息不准确，编辑是没办法查的。我碰到过无数次……你比对的序列是登陆到NCBI的，单具体到某一株系，还是可能产生突变。换一对再试试吧。我的模板是总DNA，我下的NCBI里面登陆的，引物比对100%符合，是与文献里面引物设计的区域一致。理论上如果体系不好，...
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1 模板是什么？总DNA？质粒？RT产物？尝试将模板稀释10倍
2 做个温度梯度。
3 文献里的引物有可能是不对的，写文章的时候引物信息不准确，编辑是没办法查的。我碰到过无数次……你比对的序列是登陆到NCBI的，单具体到某一株系，还是可能产生突变。换一对再试试吧。
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按照正常的思路，一样一样的排除原因。这么小的片度，应该是比好扩的，所以首先排除模板的问题：可以用同样的模板扩增一下其他片段，来排除模板的问题。
第二，排除一下酶的问题：用同样的酶是否能扩增出其他片段？
我觉得PCR条件的可能性不大，引物的可能性也不大。如果是CDNA模板的话，还有一个表达量的问题。
希望有用。...
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按照正常的思路，一样一样的排除原因。这么小的片度，应该是比好扩的，所以首先排除模板的问题：可以用同样的模板扩增一下其他片段，来排除模板的问题。
第二，排除一下酶的问题：用同样的酶是否能扩增出其他片段？
我觉得PCR条件的可能性不大，引物的可能性也不大。如果是CDNA模板的话，还有一个表达量的问题。
希望有用。
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