检测生物组织中的糖类 蛋白质 和脂肪的实验 要求有详细实验步骤和注意事项还有实验现象

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检测生物组织中的糖类 蛋白质 和脂肪的实验 要求有详细实验步骤和注意事项还有实验现象

1.总糖测定

原理：多糖经热稀盐酸彻底水解后转化成还原糖,还原糖可用费林氏容量法定量,以此计算出样品中总糖含量.
    1 试剂

 浓盐酸：密度1.18g/mL.

氢氧化钠溶液：6mol/L.
   费林氏试剂
   A液：溶解69.28g五水合硫酸铜（GB 665,CuSO4·5H2O）于水中,定容至1000mL,过滤后备用.
   B液：溶解346g酒石酸钾钠（GB 1288,NaKC4H4O6·4H2O）和100g氢氧化钠（4.1）于水中,定容至1000mL,过滤后备用.
 葡萄糖标准溶液：精确称取烘干的葡萄糖1.0000g,精确到0.0001g,用水溶解,加入5mL浓盐酸,再以水配制成10g/L浓度溶液定容至1000mL,成为1g/L浓度溶液.
 次甲基蓝（HG B33 94）指示液：10g/L.
 实验步骤
    1 称样和水称取0.25g试样,精确到0.0001g,小心地倒入圆底烧瓶中,加100mL水和10mL浓盐酸.烧瓶瓶口插上回流用的玻璃管,置100℃沸水浴上水解3h.冷却后过滤.滤渣用100mL水无损地洗回到圆底烧瓶中,再加酸10mL,重复上述操作.合并两次过滤液,用6mol/L氢氧化钠溶液调节pH至 中性（用pH纸测试）,适当加热浓缩后定容至250mL.

    2 费林氏液的标定：准确吸取费林氏A液和B液各5mL于 250mL锥形瓶中,混匀,加玻璃珠数粒,置于石棉网上加热.快速从滴定管中放入葡萄糖标准溶液49mL,调节温度,使之在2min内沸腾,保持微沸2min,期间加入次甲基 蓝指示液3滴；随后逐滴加入葡萄糖标准溶液,直至蓝色褪尽.滴定过程须在3min总沸腾时间内完成.10mL费林氏混合液需耗葡萄 糖标准溶液50mL左右.该滴定值为所配制的费林试剂标定值.在大批样品测定时,可将A、B液等体积混合后标定和使用,混合液保存不宜超过一个月.
    3 试样液的滴定：250mL锥形瓶中加入费林A、B液各5mL,混匀,再加入试样液10～20mL,加玻璃珠数粒,置于石棉网上加热.在正式滴定前, 应先用一份试样进 行粗滴定,一边加热一边逐滴加入葡萄糖标准液,确定出试样液大致耗糖体积.正式滴定时,锥形瓶加热后应快速从滴定管中放出比实际少1mL左右的葡萄糖标准液,其他操作同费林氏液的标定.
    结果计算
       总糖（％）=〔（V0-V1）×0.001×250]/V2×m×（1-X）〕×100
    式中：V0── 10mL费林氏混合液耗葡萄糖标准液的体积,mL；
          V1── 试样液滴定时耗葡萄糖标准液的体积,mL；
          V2── 试样液吸取体积,mL；
          m── 试样的质量,g；
          0.001── 1mL葡萄糖标准液中葡萄糖质量,g；
          250── 两次水解液合并后定容的体积,mL；
          X── 样品含水量,％.

2.蛋白质测定

原理

　　蛋白质是含氮的有机化合物.食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵.然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量.

　　1. 有机物中的胺根在强热和CuSO₄,浓H₂SO₄ 作用下,硝化生成（NH₄）₂SO₄

反应式为：

　　2NH₂+H₂S0₄+2H＝(NH₄)₂S0₄ （其中CuSO4做催化剂）

　　2. 在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH₃ ,收集于H₃BO₃ 溶液中

　　反应式为:

　　(NH₄)₂SO₄+2NaOH＝2NH₃+2H₂O+Na₂SO₄

　　2NH₃+4H₃BO₃＝(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

　　3. 用已知浓度的H₂SO₄（或HCI）标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　(NH₄)₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O＝(NH4)2SO4+4H₃BO₃

　　(NH₄)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O＝2NH₄Cl+4H₃BO₃

试剂

　　所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制.

　　硫酸铜.

　　硫酸钾.

　　硫酸.

　　2%硼酸溶液.

　　混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合.也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合.

　　40%氢氧化钠溶液.

　　0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液.

操作方法

　　1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg）,移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜,6g硫酸钾及20毫升硫酸,稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上,小火加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5小时.取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用.取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验.

　　2、 按图装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水.

　　3、 向接收瓶内加入10ml
2%硼酸溶液及混合指示剂1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室,并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞.将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其缓慢流入反应室,立即将玻璃盖塞紧,并加水于小玻璃杯以防漏气.夹紧螺旋夹,开始蒸馏,蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏5min.移动接收瓶,使冷凝管下端离开液皿,再蒸馏1min,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部.取下接收瓶,以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点.

　　同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作.

计算

　　X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%　

　　X：样品中蛋白质的百分含量,g；

　　V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积,ml；

　　V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积,ml；

　　N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

　　0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

　　m：样品的质量（体积）,g（ml）；

　　F：氮换算为蛋白质的系数.蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%,按16%计算乘以6.25即为蛋白质,乳制品为6.38,面粉为5.70,玉米、高粱为6.24,花生为5.46,米为5.95,大豆及其制品为5.71,肉与肉制品为6.25,大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为 5.30.

注意事项

　　（1） 样品应是均匀的.固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀.

　　（2） 样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上.万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低.

　　（3） 硝化时如不容易呈透明溶液,可将定氮瓶放冷后,慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml,促使氧化.

　　（4） 在整个消化过程中,不要用强火.保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失.

　　（5） 如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这样会形成硫酸氢钾,而不与氨作用.因此,当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时,要增加硫酸的量.

　　（6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点,硫酸铜为催化剂,硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂.

　　（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色.如果没有溴甲酚绿,可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液.

　　（8） 氨是否完全蒸馏出来,可用PH试纸试馏出液是否为碱性.

　　（9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸,过剩的酸液用0.01N碱液滴定,计算时,A为试剂空白消耗碱液数,B为样品消耗碱液数,N为碱液浓度,其余均相同.

　　（10） 以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,亦可免去用移液管,操作比较简便.

　　（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀物,这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀.有时铜离子与氨作用,生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+

　　（12） 这种测算方法本质是测出氮的含量,再作蛋白质含量的估算.只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量.

3.脂肪的测定

原理：将试样与盐酸溶液一同加热进行水解,使结合或包藏在组织里的脂肪游离出来,再用乙醚和石油醚提取脂肪,回收溶剂,干燥后称量,提取物的重量即为脂肪含量.

操作方法

 (1)水解

      称取一定量样品于试管中,加入10m1盐酸,混匀.将试管放入70-80℃水浴中,每5-10分钟用玻璃棒搅拌一次,至样品脂肪游离消化完全为止,约需40-50分钟.

（2）提取

   取出试管,加入10ml乙醇,混合,冷却后将混合物移入100ml具塞量筒中,用25mL乙醚分次洗试管,一并倒入量筒中,待乙醚全部倒入量筒后,加塞振摇1分钟,小心开塞放出气体,再塞好,静置12分钟,小心开塞,用石油醚一乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪.静置10-20分钟,待上部液体清晰,吸出上清液于已恒重的锥形瓶内,再加5ml乙醚于具塞量筒内,振摇,静置后,仍将上层乙醚吸出,放入原锥形瓶内.

(3)回收溶剂、烘干、称重

   将锥形瓶于水浴上蒸干后,置100 -105℃烘箱中干燥2小时,取出放入干燥器内冷却30分钟后称量,并重复以上操作至恒重.

结果计算

脂肪（%）=（m2-m1）/m×100%

式中：m2   锥形瓶和脂类质量,g; 

m1    空锥形瓶的质量,g;

m     样品的质量 ,g

分辨率：
A，电影和缩二脲试剂试剂虽然相同的成分，但浓度，用法，用量是不同的，如电影试剂B液（0.05g/ml）和双缩脲试剂B液（0.01克/毫升）用不同浓度，使故障。 />乙，脂肪材料的识别给定的两个方法：检测到的宏小区脂肪的花生种子，粉碎后得到的样品溶液，以及佳苏丹III染色可直接观察到，而无需使用显微镜。第二种方法必须是脂肪。 B错
D，缩二脲的蛋白质鉴定，没有水洗澡，D...

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分辨率：
A，电影和缩二脲试剂试剂虽然相同的成分，但浓度，用法，用量是不同的，如电影试剂B液（0.05g/ml）和双缩脲试剂B液（0.01克/毫升）用不同浓度，使故障。 />乙，脂肪材料的识别给定的两个方法：检测到的宏小区脂肪的花生种子，粉碎后得到的样品溶液，以及佳苏丹III染色可直接观察到，而无需使用显微镜。第二种方法必须是脂肪。 B错
D，缩二脲的蛋白质鉴定，没有水洗澡，D错
正确答案选项C.

房东，不知道答案，满足你吗？

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